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Western Blot专辑(二)

抗体的选择:

1.如何选择合适的一抗?
请先确定您检测样品的种属,然后查找相关产品,根据说明书上描述的“适用种属和实验方法”来确定合适的抗体。如果说明书中有明确您要检测的种属和实验方法均经过检测,则您可以放心地购买该产品。如果说明书中没有注明您用的种属和实验方法经过验证,则要仔细考虑是否购买。

2.如何选择合适的二抗?

选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求,一般来说需要从下面几个方面考虑:
【一抗的种属来源】
二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源,例如:如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体,二抗则选抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体,则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。

【一抗的类别亚型】
二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体。其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1IgG2aIgG2bIgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下,可以选用抗相应物种 IgG。聚研生物能为您提供通用的IgG(H+L)二抗,或者特异性只结合IgMAnti IgM (mu) AntibodyIgAAnti IgA (alpha) AntibodyIgEAnti IgE (epsilon) Antibody等。
【二抗的种属来源】
一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里,如双标实验里,如果其中一个一抗是山羊来源的,一个是小鼠来源的,则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗,这时候,二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。

【二抗的耦联标记】
一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAPPAP),荧光基团(FITC RhodamineTexas RedPERhodamineAlexa Fluor(R) 488Alexa Fluor(R)555Alexa Fluor(R)647Dylight等)、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western BlotELISA,最常用的二抗是酶标二抗;而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用Biotin/Avidin检测系统。在一些荧光检测方案中,则需要选择不同的荧光标记;而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。
【是否经过血清吸附过的二抗】

如您的检测样本是人源的蛋白,一抗是小鼠源的单克隆抗体,二抗就需要选择抗小鼠源的二抗,如果您对实验的特异性要求很高,那聚研生物向您推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗,这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织(如IgG等)可能发生非特异性反应的IgG,因此将非特异性结合降低到最低。如KPLHRP Labled Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed二抗就是经过人血清吸附过的。而Anti-Mouse IgG (H+L), Extra Serum Adsorbed, Peroxidase-labele二抗则是经过多种血清吸附过的二抗。
Anti-IgG还是Anti-IgG, F(ab)2 fragment
在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内,通常含有较多的Fc受体,这时候选择二抗时最好选择Anti-IgG, F(ab)2 fragment这样的特异性二抗,这样就消除了由于Fc部分与IgG的非特异性结合。常规的Anti-IgG (H+L)二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应,即与IgGFcF(ab)2片段都能结合;由于IgGIgMIgA都有保守的轻链结构域,因此Anti-IgG (H+L)与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F(ab)2 fragment经过了IgG Fc片段的吸附,因此只与IgGF(ab)2片段结合,然而IgGIgMIgA都有保守的轻链结构域,因此与它们也有交叉反应。

关于磷酸化蛋白检测的注意事项:

1. 保持待测蛋白处于磷酸化状态!在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂,并将标本时刻保持在冰浴中!

2. 使用5%BSA 作为封闭试剂!不能使用脱脂奶粉!(因为脱脂奶粉中含有酪蛋白,会出现高背景)

3. 请谨记蛋白的磷酸化是需要诱导的!当信号低或者无信号时有可能是磷酸化诱导不充分!确保使用阳性对照!

WB过程中常见的问题及可能原因分析

 

问题  可能原因 验证或解决办法
转膜不充分 膜没有完全均匀湿透 使用100% methanol浸透膜
靶蛋白分子量小于10,000 选择小孔径的膜,缩短转移时间
靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液(pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液
甲醇浓度过高 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
转移时间不够Thick gel 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间
背景高 膜没有完全均匀湿透 使用100% methanol浸透膜
洗膜不充分 增加洗液体积和洗涤次数
阻断不充分 增加封闭液孵育时间,或者提高温度。选择合适的封闭试剂(脱脂奶粉,BSA,酪蛋白等)
二抗浓度过高 降低二抗浓度
检测过程中膜干燥 保证充分的反应液,避免出现干膜现象
曝光过度 缩短曝光时间
抗体与阻断蛋白有交叉反应 检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应
没有阳性条带 抗体染色不充分 增加抗体浓度,延长孵育时间
酶失活 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
试剂不匹配 一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
一抗失效 选择在有效期内抗体;并选择现配现用的工作液
HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
有阳性条带,但条带比较弱 抗体染色不充分 增加抗体浓度,延长孵育时间
酶活性降低 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
标本中靶蛋白含量太低 增加标本上样量。
洗膜过度 缩短洗涤时间
HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
抗体活性降低 选择在有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置
蛋白转移不充分 见上述
封闭过度 减少封闭剂的量或缩短时间;换用不同封闭剂类型
曝光时间过短 延长曝光时间
HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
条带位置(大小)不对;或有非特异性条带 二抗的非特异性结合 增加一个对照:不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗(特异性更强的,只针对重链的)
一抗的特异性不够 使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体的特异性
蛋白降解 使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂
二聚体或多聚体存在 增加蛋白质变性过程及强度
抗体浓度过高 降低抗体(一抗、二抗)浓度,可以减少非特异性条带
蛋白上样量过大 降低上样量
背景有斑点 封闭剂中有聚集体 使用前过滤封闭试剂
HRP耦联二抗中有聚集体 过滤二抗试剂,去除聚集体
膜上出现反像(暗背景上白色带) HRP含量过高 降低酶联二抗的浓度

 

发布日期:2010-8-31 【返回】