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Western Blot 解决方案

Western Blot概述:

Western BlotWB)是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB进行蛋白质分析最流行和作成熟的技术之一,超过60% 的生命科学工作者使用该方法。

根据凝胶电泳的类型,WB可分为:
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还原(变性)WB:最常用的一类,使用SDS-PAGE电泳。主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等
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非还原(非变性)WB:主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。一般不使用SDSDTT等变性剂。

成功完成Western Blot检测,必须满足4个条件:
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凝胶洗脱:转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析
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吸附到膜上:在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上,如果蛋白不吸附,将无法在膜上进行分析
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处理期间仍截留在膜上:在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
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处理过程中可接近:被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触,如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测,则设置合适正确的对照是必不可少的,只要正确设置了这些对照,即可快速和准确的找到WB的问题所在,并保证实验结果的准确性和特异性!一般需要设置的对照如下:
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阳性对照:明确表达检测蛋白的组织或细胞,用于检测抗体的工作效率
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阴性对照:明确不表达检测蛋白组织或细胞,用于检测抗体的特异性
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二抗对照:不加一抗,用于检测二抗的特异性
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内参对照:检测标本的质量和二抗系统
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空白对照:不加一抗和二抗;用于检测膜的性质和封闭的效果

 

Western Blot实验流程:

 

抗体的选择:

1.如何选择合适的一抗?
请先确定您检测样品的种属,然后查找相关产品,根据说明书上描述的“适用种属和实验方法”来确定合适的抗体。如果说明书中有明确您要检测的种属和实验方法均经过检测,则您可以放心地购买该产品。如果说明书中没有注明您用的种属和实验方法经过验证,则要仔细考虑是否购买。


2.如何选择合适的二抗?

选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求,一般来说需要从下面几个方面考虑:
【一抗的种属来源】
二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源,例如:如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体,二抗则选抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体,则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。

【一抗的类别亚型】
二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体。其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1IgG2aIgG2bIgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下,可以选用抗相应物种 IgG。聚研生物能为您提供通用的IgG(H+L)二抗,或者特异性只结合IgMAnti IgM (mu) AntibodyIgAAnti IgA (alpha) AntibodyIgEAnti IgE (epsilon) Antibody等。
【二抗的种属来源】
一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里,如双标实验里,如果其中一个一抗是山羊来源的,一个是小鼠来源的,则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗,这时候,二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。

【二抗的耦联标记】
一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAPPAP),荧光基团(FITC RhodamineTexas RedPERhodamineAlexa Fluor(R) 488Alexa Fluor(R)555Alexa Fluor(R)647Dylight等)、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western BlotELISA,最常用的二抗是酶标二抗;而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用Biotin/Avidin检测系统。在一些荧光检测方案中,则需要选择不同的荧光标记;而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。
【是否经过血清吸附过的二抗】

如您的检测样本是人源的蛋白,一抗是小鼠源的单克隆抗体,二抗就需要选择抗小鼠源的二抗,如果您对实验的特异性要求很高,那聚研生物向您推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗,这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织(如IgG等)可能发生非特异性反应的IgG,因此将非特异性结合降低到最低。如KPLHRP Labled Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed二抗就是经过人血清吸附过的。而Anti-Mouse IgG (H+L), Extra Serum Adsorbed, Peroxidase-labele二抗则是经过多种血清吸附过的二抗。
Anti-IgG还是Anti-IgG, F(ab)2 fragment
在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内,通常含有较多的Fc受体,这时候选择二抗时最好选择Anti-IgG, F(ab)2 fragment这样的特异性二抗,这样就消除了由于Fc部分与IgG的非特异性结合。常规的Anti-IgG (H+L)二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应,即与IgGFcF(ab)2片段都能结合;由于IgGIgMIgA都有保守的轻链结构域,因此Anti-IgG (H+L)与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F(ab)2 fragment经过了IgG Fc片段的吸附,因此只与IgGF(ab)2片段结合,然而IgGIgMIgA都有保守的轻链结构域,因此与它们也有交叉反应。
Anti-IgG(H+L)Anti-IgG (gamma)Anti-IgM (mu)Anti-IgA (alpha)
在一些特殊的实验里,只需要检测样本里的IgG或者IgM,常规的Anti-IgG (H+L)由于与IgG的重链和轻链都有结合反应,而IgGIgMIgA都有保守的轻链结构域,因此不能特异性的检测某种类型的IgG或者IgM

 

关于磷酸化蛋白检测的注意事项:

1. 保持待测蛋白处于磷酸化状态!在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂,并将标本时刻保持在冰浴中!

2. 使用5%BSA 作为封闭试剂!不能使用脱脂奶粉!(因为脱脂奶粉中含有酪蛋白,会出现高背景)

3. 请谨记蛋白的磷酸化是需要诱导的!当信号低或者无信号时有可能是磷酸化诱导不充分!确保使用阳性对照!

 

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发布日期:2010-9-7 【返回】