Western Blot专辑（一）

Western Blot概述：

Western Blot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB进行蛋白质分析最流行和作成熟的技术之一，超过60% 的生命科学工作者使用该方法。

根据凝胶电泳的类型，WB可分为：
*还原（变性）WB：最常用的一类，使用SDS-PAGE电泳。主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等
*非还原（非变性）WB：主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。一般不使用SDS、DTT等变性剂。

成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：
*凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析
* 吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析
*处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
*处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：
*阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
*阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
*二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性
*内参对照：检测标本的质量和二抗系统
*空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果

Western Blot实验流程：

一．配胶

1． 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O 冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2． 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED 外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED 浓度到《分子克隆》建议浓度。

3． 封胶：

灌入2/3 的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。

4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O 冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

二．样品处理

1．培养的细胞（定性）：

⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3 遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

⑵ 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

⑶ 100℃，1min。

⑷ 用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3 次。

⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g 离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml 注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

⑹待样品恢复到室温后上样。

2．培养的细胞（定量）：

⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3 遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2 次。

⑷ 12000g离心，4℃，2min。

⑸ 取少量上清进行定量。

⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。

3．组织：

10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉。

⑴匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg 加1ml 裂解液，肺100~200mg 加1ml 裂解液。可

手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。

⑵ 12000g离心，4℃，2min。

⑶ 取少量上清进行定量。

⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。

三．电泳

1．上样前将胶板下的气泡赶走。

2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer 上样，Marker 也用1×loading buffer 调整至与样品等体积。

2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。

3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。

四．转膜

1．电泳结束前20 分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。

浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也

浸入转移液中。

2．取胶：

将胶卸下，保留30-100KD 或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）

3．转膜：

湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml 电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。

干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。

电转液配方： Tris-base 3g, glycine 14.4g, 200ml 甲醇/1L

电泳液配方：Tris-base 3g, glycine 14.4g, 0.1% SDS（10ml 10% SDS）/L

Tris-base 1.5g, glycine 7.2g, 0.1% SDS（5ml 10% SDS）/0.5L

裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM

由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。

1×loading buffer 配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。

五．封闭及杂交

1．封闭：

将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。

必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTB将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker 则可省略此步。

2．结合一抗：

一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml 一抗稀释液。

反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western 膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。

3．洗涤：

一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4．结合二抗：

根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP 或AP 标记的抗体，按相应比例稀释

（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。

5．洗涤：

二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

六．发光鉴定

 一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。

1．HRP-ECL发光法：

将A、B 发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

2．AP-NBT/BICP显色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml 水中，使用前将一片分装在30 个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml 即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP 溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s 观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

七．增强敏感性

若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：

1． 用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。

2． 将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2 次液。

3． 封闭40~60min

4． 一抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。

PBST： 1×PBS TTBS： Tris-HCl 20mM, pH 7.4 (25℃)

Tween-20 0.01% ~0.02% NaCl 150mM

Tween-20 0.05%

封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST或 TTBS

加入10g脱脂奶粉即为封闭液。

背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。

5． PBST或TTBS洗膜20min，期间换2 次液。

6． 二抗杂交，37℃ 1h。

7． PBST或TTBS洗膜20min，期间换2 次液。

8． 发光鉴定。

9． 若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2 次液。

10．三抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。

11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2 次液。

12．发光鉴定。